一、三叶青的真伪鉴定
由于资源稀缺而需求量大,伪混品众多,2010—2011年杭州、东阳等地先后出现多起患者因服用三叶青导致中毒事件,出现口舌发麻、视物不清的症状后经检查,确定造成此现象的系处方中三叶青饮片混有乌头类植物子根的生品乌头碱对各种神经痛和痛风有镇痛作用,但由于其毒性太大,早已不作临床用药。乌头类植物的生品多含有乌头碱,乌头碱中毒剂量(口服)为0.2mg,致死量为2.5mg。三叶青服用方法通常有两种,一是水煎服,一是打粉直接吞服。鸟头类生品通过水煎煮能将部分鸟头碱破坏,降低其毒性。而三叶青粉末通常是直接服用,由于伪品未经煎煮,则毒性更大,危害更大。浙江省食品药品监管局随后在全省范围内展开专项整治行动,发现多家知名药企均涉案,一个月内仅杭州市就查处没收了三叶青假劣药700kg左右。
豆科土圞儿属植物土圞儿,与三叶青原植物形态较相似,均为小叶草质藤本的块根,药材性状也近似,而且有的地方将其称为黄皮三叶青或三叶青,极易混淆(图2-18~图2-20)。土圞儿始载于明《救荒本草》,近期使用少,即两者的使用历史及性味功效均有较大差异,应区别使用。三叶青药材来源品种混乱严重影响了其疗效及安全性。
1、外部形态、显微结构或理化鉴别方法
三叶青块根外形成椭圆形,但其中有许多是呈酒葫芦状,这是其独特的外貌特征。因体內淀粉含量高,干的块根也很饱满,而不干瘪皱皮。表皮颜色呈棕褐色,其中也有呈金黄色(较年轻)和暗红色(年老)的。内在无肉眼可见的粗纤维,颜色呈银白色,口尝除略带有青草味外,无药味,不苦不涩。李水福从原植物形态、药材性状和显微鉴别三方面总结了三叶青与其常见伪品土闋儿的区别特征(表2-2)。
殷红妹通过性状观察、理化鉴别和高效液相色谱法成功鉴别了三叶青及其伪混品乌头。正品切面类白色或粉红色,形成层环不明显,可见突起的茎痕。伪品切面类白色或浅灰黄色,形成层环明显呈多角形,可见凹陷的芽痕通过高效液相色谱法或薄层色谱法检测伪品均能检测出乌头碱,为鸟头类植物子根所含成分,而正品中均不能检测出。然而传统中药材外部形态、显微结构或理化鉴别方法由于产地粗加工和饮片炮制导致外部性状、显微特征破坏,且同一药材的化学成分含量受生长周期、储存条件、炮制方法和生长环境等多方面的影响会有明显变化,因此传统鉴别方法均存在一定局限性。
2、分子生物学鉴别方法
分子生物学鉴定技术不受供试部位、生长发育阶段以及环境条件的影响,直接利用DNA序列进行物种的鉴定,具有独一无二的准确性和可重复性,实验过程标准化,操作简单快速。
(1)位点特异性鉴别PCR
中国专利6ZL2013103738094公开了一种利用位点特异性鉴别PCR的三叶青真伪鉴定方法。通过选择具有多态性的ISSR通用引物UBC843扩增所得的三叶青特异性核苷酸序列,设计了特异性扩增该片段的特异性三叶青SCAR分子探针引物,在12个不同种源的三叶青中均可扩增出1800bp左右条带,而与三叶青伪品土闋儿和16个近缘物种的DNA均不反应。据此条带区分三叶青和其他易混物种。
(2)DNA条形码技术
三叶青及其他23种崖爬藤属植物的rbcL、mattKtmH-psbA、mS等多段DNA条形码序列测定分析结果表明,三叶青可以被ISIS+rheL、IIs+tmH-psbA、rhL+matK及2+ⅹ组合条形码准确鉴定,虽然多片段组合条形码具有比IS更高的支持率,但联合条形码的研究费用明显多于单片段条形码,且数据分析难度大,因此从实用角度考虑,IS是适于鉴别三叶青及其近缘种的条形码,可通过对待测样品DNA条形码区测序后,计算遗传距离聚类鉴别。
(3)PCR-RFP方法
编者研究团队的中国发明专利8:ZL201510016354公开了一种快速、可靠鉴别三叶青的PCR-BFP方法(图2-21)。在前期以TS序列为基因标记,探讨三叶青与其近缘物种亲缘关系及其多种伪混品的核糖体DNA的内转录间隔区(mS2)序列测定的研究基础上,依据三叶青中特异的限制性内切酶NCO识别位点开发的一种快检方法。包括提取药材DNA,PCR扩增内转录间隔区IS2序列及用限制性内切酶NCO消化PR产物,正品药材产生2条DNA片段,各种伪品均为1条条带。可直观判断药材三叶青的真伪。能有效缩短三叶青的鉴定时间,且该方法扩增的ⅣS2片段仅为40~500bp,因此受模板质量及PCR扩增条件的影响较小,不易出现假阴性的结果,大大提高了鉴定的准确性。
(4)DNA模拟酶高效可视化鉴别
编者研究团队的中国发明专利9ZL201610308445.5公开了一种利用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪的方法。设计一段与三叶青特异序列互补的发卡型核酸探针用于样品的检测。通过被子植物的IS2序列的通用引物对待测样品DNA进行PCR特异性扩增,所得PCR产物中目标序列与核酸探针杂交形成的血红素-G-四链体hemin dna模拟酶能催化ABTS-H2O2体系显色。正品三叶青药材显绿色,各种伪品均不显色,肉眼观察颜色变化即可快速、直观地鉴别药材真伪。该方法成本低,程序简单,重现性好,稳定性好,且避免了凝胶电泳分析,节省了大量时间能够直接用于快速可视化鉴别三叶青真伪,有望在药材市场及食品安全领域得到
广泛应用。
以上三叶青种质鉴别的分子生物学方法克服了感官或理化分析等方法难以鉴别三叶青真伪的技术问题,保障了三叶青药材用药安全,具有重要的实用价值。
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