设计激酶共价抑制剂通常着眼于靶蛋白结合部位中具有高反应活性的半胱氨酸Cys残基。近年来的若干研究表明也可以靶向赖氨酸Lys进行共价抑制剂的设计。通常状态下的半胱氨酸的pKa仅为8.5，具有很强的亲核性且容易被氧化。然而，通常状态下的赖氨酸pKa为10.4，生理条件下赖氨酸会发生质子化，无法成为亲核试剂。要使赖氨酸具有亲核性，就需要将它的pKa至少下降3个pH单位。因此，准确计算赖氨酸的pKa值，预测蛋白结构中高反应活性的赖氨酸位点，将对靶向赖氨酸的共价抑制剂设计提供指导。
最近，美国马里兰大学Jana Shen教授课题组使用连续恒定pH分子动力学模拟方法（continuous constant pH molecular dynamics, CpHMD）对激酶家族蛋白中的催化赖氨酸pKa（ATP结合位点附近）进行计算，4个结构的赖氨酸和半胱氨酸的pKa计算值与实验测量值基本一致，8种激酶蛋白的催化赖氨酸被预测具有亲核性，作者也对激酶其他位置的高反应活性赖氨酸和半胱氨酸进行了预测。基于这些研究，作者认为可以对II型激酶抑制剂进行修饰获得选择性更强的靶向赖氨酸的共价激酶抑制剂。相关研究发表在最新一期的美国化学会会志上（J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 6553-6560.）。
CpHMD模拟方法，源于用于计算自由能的λ-动力学，需要滴定的氢正离子被设置为“虚氢原子”（dummy hydrogens）并用一组虚拟λ坐标表示，坐标的两端代表质子化和去质子化状态，λ坐标与空间坐标同时传播，使用GB-Neck2隐式溶剂模型计算λ坐标的受力和能量。为了加速pKa值的收敛，CpHMD也采用了pH副本交换模拟方法。在Jana Shen教授前期工作中，CpHMD方法在天门冬氨酸，谷氨酸和组氨酸的pKa预测中均取得了很好的预测效果（J. Chem. Inf. Model. 2018, 587, 1372-1383），因此对赖氨酸和半胱氨酸的pKa进行预测有利于拓展该方法的适用范围。
激酶的催化结构域由富含β-折叠N-叶和α-螺旋C-叶组成，N-叶中的αC螺旋含有极其保守的Glu，当激酶活化时会与β3链上的催化赖氨酸形成盐桥。活性位点附近位于A loop上的三个极其保守的残基Asp，Phe和Gly，称为DFG基序。DFG基序可以采用两种不同的构象，DFG-in，其中Asp侧链指向ATP结合位点并与催化赖氨酸形成盐桥；DFG-out，其中Asp侧链指向外部，但Phe侧链指向内部。加之αC构象的不同，激酶可以分为DFG-in/αC-in（DICI），DFG-out/αC-in（DOCI），DFG-in/αC-out（DICO）以及DFG-out/αC-out（DOCO）四种构象。
图-1 激酶蛋白结构（EGFR, PDB代码5U8L）以及预测的具有反应性的赖氨酸（蓝色）和半胱氨酸（橙色，已有共价抑制剂靶向；黄色，该工作中的前瞻性预测）
溶剂暴露程度是影响残基pKa的主要决定因素，水环境可以稳定带电残基，疏水环境则可以稳定中性残基。静电相互作用以及氢键也可能影响残基pKa值，例如盐桥可以稳定带电的赖氨酸，导致其pKa升高。在激酶的DICI，DOCI和DICO构象中，赖氨酸会与Glu或Asp形成盐桥，从而失去亲核性，只有在DOCO构象中，赖氨酸才可能具有较高的反应活性。除了构象上的考虑，作者还限制赖氨酸与Glu或Asp之间的距离要大于4 Å，最终作者从KLIFS激酶数据库中（8854个结构，306个DOCO结构）选择了18个不同种类的激酶蛋白DOCO结构作为研究对象。
为了验证CpHMD方法的准确性，作者首先对已实验测定的具有高反应活性的赖氨酸和半胱氨酸结构进行了模拟和计算，发现CpHMD方法可以准确重现实验测得的pKa值。工程葡萄球菌核酸酶SNase突变体V74K，V99K，L125K三个赖氨酸的pKa实验值分别为7.4，6.5和6.2，而相应的CpHMD计算值为6.8，5.8和5.6。肌酸激酶中半胱氨酸C283的实验pKa值为5.6，CpHMD计算值则为5.5。有趣的是，赖氨酸的pKa计算值整体比实验值偏小约0.6单位，作者推测这可能是GB-Neck2模型过高估计了带电赖氨酸的去溶剂化能量损失。
接着作者对18个激酶复合物结构进行了预测，作者设定pKa值低于7.8和6.8来定义反应性和高反应性赖氨酸。根据该标准，八种不同的激酶蛋白中含有反应性催化赖氨酸，包括EGFR，MET，RIPK1，PDK1，CDK6，NEK2，Aurora和PEK，其中RIPK1和CDK6，具有高反应性催化赖氨酸。通过观察MD轨迹，作者发现其他不具有反应性的赖氨酸在模拟过程中大都暴露在水环境中或与DFG-Asp和αC-Glu相互作用。作者发现蛋白其他位置的赖氨酸和半胱氨酸也可能具有反应性，尤其是位于roof位置和DFG+2位置的半胱氨酸已经是目前临床和候选药物的共价结合位点。另外，由于所选择的DOCO结构多数结合II型激酶抑制剂，因此作者认为可以对这些化合物进行修饰获得靶向赖氨酸的选择性更强的共价激酶抑制剂。
图-2 CpHMD模拟计算半胱氨酸和赖氨酸的pKa值（a）肌酸激酶中的Cys283（品红）和SNase突变体V74K（蓝色）的模拟滴定曲线，插图中给出了两个蛋白所有半胱氨酸和赖氨酸的pKa计算值，pKa高于11表示为11。（b）肌酸激酶（1I0E）和SNase突变体V74K（3RUZ）的结构，突出显示Cys283和Lys74，括号外为计算值，括号里为实验值。
综上所述，Jana Shen教授课题组发展的连续恒定pH分子动力学模拟方法能够较好重现实验测定的赖氨酸和半胱氨酸pKa值。在激酶家族可能的反应性氨基酸预测中，8种激酶蛋白的催化赖氨酸被预测为具有反应性，激酶其他多个位点的赖氨酸和半胱氨酸也被预测为具有反应性，部分预测结果与已有研究一致。传统的共价药物多数都是偶然发现的，Jana Shen教授评估残基反应性的策略可以为共价抑制剂的设计提供有力的指导，加速共价药物的研究步伐。
参考文献：
(1) Ruibin Liu, Zhi Yue, Cheng-Chieh Tsai, and Jana Shen. Assessing Lysine and Cysteine Reactivities for Designing Targeted Covalent Kinase Inhibitors. J. Am. Chem. Soc.** 2019**, 141, 6553-6560. DOI: 10.1021/jacs.8b13248
(2) Yandong Huang, Robert C. Harris, and Jana Shen. Generalized Born Based Continuous Constant pH Molecular Dynamics in Amber: Implementation, Benchmarking and Analysis. J. Chem. Inf. Model. 2018, 587, 1372-1383. DOI: 10.1021/acs.jcim.8b00227
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