头颈部鳞状细胞癌microRNAs分型：上皮型和基质型
文章由田纳西大学健康科学中心，北卡罗来纳大学联合韩国天主教大学于今年11月刚刚发表，利用无监督模型对于头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)基于miRNA分为“上皮型”和“基质”两种临床亚型。对于希望做癌症分型的研究人员，很有借鉴价值。
研究概述|确定是否可以根据miRNA进行HNSCC分类
数据概览|2个独立队列数据，分别使用miRNA微阵列和miRNA测序，另外借助TCGA和PaVE数据库做meta分析和下游分析
分析亮点| MicroRNA结合mRNA分析及癌症临床亚型分型
MicroRNAs是一种小且高度保守的非编码RNA分子，通过与靶mRNA结合并抑制其转录，进而调节基因表达，从而影响干细胞特性、分化和肿瘤发生。但是在科研方面，很大程度受到组织鲜活度，从而影响其降解，很难从FFPE组织中获得。但是HNSCC鲜活组织中检测到的miRNA被很多研究报道，但是个体肿瘤差异研究依然很少。
队列数据获取
测试队列 --文章作者使用成人口腔、口咽、下咽和喉部手术切除组织，10个正常对照，包括5个肿瘤邻近的正常样本和5个正常扁桃体组织样本。经过实验提取并剔除低质量样本，最终保留88个肿瘤和10个正常样本队列。并且GEO中可以获得（GSE144711），该队列将作为测试队列。
验证队列 --另外TCGA中获取HNSCC相关的528个肿瘤数据，有474同时含有mRNA和miRNA数据，正常样本为44个。所有miRNA-seq数据均为归一化和log2-transform表达，单位为每百万读数，而mRNA-seq数据包括归一化和log2-transform的RSEM表达。
患者临床数据从PaVE数据库(https://pave.niaid.nih.gov/)获取患者HPV状态，经HPV mRNA mapping 后，如果超过1000read，则认为患者为HPV肿瘤，病毒序列基因主要是E6和E7。
miRNA过滤、分类和验证
大部分miRNA在细胞中表达较低甚至不具有生物活性，因此，文章只考虑了聚类后平均绝对偏差(MAD) > 75%的可变miRNAs。这里利用integrative correlation coefficients (ICC)10%的50个miRNA作为考量并用于后续的分析。
ConsensusClusterPlus R包(RRID:SCR_016954)通过平均连锁层次聚类，确定每个队列可能分配的miRNAcluster范围。使用SigClust R软件包评估聚类的统计学意义。应用质心预测，对单个样本分类，确定测试队列和验证队列中的每个cluster的质心。通过计算到每个质心的相关距离(1 - Pearson相关系数)，确定每个类的标签。并根据miRNA这个分类方法，应用到TCGA的膀胱、宫颈和肺鳞状癌的验证数据中。
差异表达基因和microRNAs
采用似然比检验方法，识别TCGA组群cluster间差异表达的miRNA (DEmiRs)。FDR阈值为0.05使用DEGseq的R包实现。在HPV(+)和HPV(-) TCGA样本之间，以及在TCGA样本中的每个miRNAcluster和正常对照样本之间，也同样测定了DEmiRS。在筛选低表达变异基因(MAD < 75%)后，同样在TCGA队列中miRNA为基础的cluster之间进行差异基因表达分析。
MicroRNA-mRNA综合分析
这里使用来自TCGA队列的基因表达数据，计算了所有可能的miRNAs和mRNA组合的Pearson相关系数Benjamini and Hochberg校正(q值)来控制多重检验。确定cutoff值为0.01的q值表示miRNA和基因之间负相关。接着使用seed mRNA来注释miRNA-gene对应关系，并进行了target gene预测。基因靶标预测方法包括:targetScan v7.2、miRwalk v3、miRTarBase v7.0和miRDB v6.0。为了对TCGA膀胱、肺和宫颈数据集进行整合分析，仅使用负相关并且TCGA HNSCC数据集中预测基因ICC值位于前75%的数据。
功能基因网络分析
这里使用监督和非监督的方法识别基因集并利用GO进行基因集富集分析(PAGE)。FDR<0.01认为具有统计学显著性。之后进行层次聚类，“cutree”进行GO功能项的聚类注释。
突变和拷贝数考量
从公共数据库获取肿瘤细胞的包括突变注释格式文件和由GISTIC方法确定的3级分段基因组区域所描述的拷贝数改变。找到与癌症最相关的前50的基因，并使用GISTIC模块v2.0.23分析了这两种亚型之间的拷贝数谱。
根据上述方法，首先获得了两个队列的人口统计学数据和miRNA分类情况，发现两个队列总体分期，HPV状态和性别分布相似。并且在UNC队列建立的分类器可以应用到TCGA的队列中，如图1A所示，8个miRNA在UNC队列I中下调，在TCGA队列II中下调，剩余的42个在UNC队列II中下调，在TCGA队列I中下调。那其他癌症呢？接着在TCGA其他癌症类型中，发现高度一致（图1B）的基于miRNA的表达模式。这个label表明，生物学过程很可能收到一组强大miRNA调节的影响。总的来说，基质亚型中miRNA的下调与mRNA的上调有关，这些mRNA参与了间充质细胞(包括肌肉、循环、骨骼和神经系统发育)衍生的基质发生过程(图1 c)。
图1，MicroRNAs鉴定两种与上皮分化阶段相关的HNSCC亚型
接下来图2显示，与正常样本相比，许多代表上皮亚型的miRNA(包括miRNA -195、-127和-125b)在两种肿瘤亚型中均下调，这表明它们可能在HNSCC中发挥整体抑瘤作用。此外，虽然基质亚型的许多miRNAs代表在正常组织中也下调，但与正常组织相比，基质亚型中先前鉴定的致癌miRNAs (miR-17/92a簇，miR-183-5p, miR-106b/25簇)明显上调。
图2，HNSCC和正常样本的差异表达miRNA
miRNA靶向与基因表达的调控要比在核酸水平上简单识别seed-seq复杂得多。如图3A观察到的肿瘤亚型的miRNA和cluster更为丰富。DAVID分析验证了miRNAs区分类别属于不同GO或功能的假设，根据上述队列中miRNA分类得到的上皮和基质亚型，研究致癌通路的激活途径差异，图3B所示，各miRNA靶基因的表达被聚合并与miRNA的表达相关联。在HNSCC中，证明了上皮亚型与RAS、PI3K和TNNB1等已知与上皮肿瘤相关的致癌通路的激活相关。而图3C所示，TCGA队列同样支持数据可以区分基质和上皮亚型。
图3，两个miRNA簇显示上皮亚型的不同表型
定义了HNSCC可重复的miRNA亚型后，探讨了它们与各种先前描述的分子标记和临床表型的关系，如图4所示。miRNA亚型存在统计学差异，口腔癌在基质亚型中发现的比例更高，而在上皮亚型中发现的口咽部、下咽和喉部肿瘤更多(p< 0.001)。另外在组织学级别上的显著差异表现在，上皮亚型中分化较好的肿瘤，基质亚型中分化较差 (p = 0.003);然而，两亚型之间的t分期晚期差异是临界不显著的(p = 0.10)。淋巴结状态在各亚型之间无显著差异(p=0.20)，但在TP53突变的肿瘤中，基质亚型中淋巴结转移的比例高于上皮亚型(58.2% vs . 0.20)48.9%;p = 0.033)。考虑到肿瘤亚型对于临床影响，并观察到在单变量分析中，基质亚型的总体患者的统计结果更差（图4B所示）。在一个子集分析中考虑了miRNA亚型对HPV(+)患者的影响，并证明了这一点HPV(+)间质患者的预后远不如HPV(+)间质患者，生存期中位数仅为3年左右，与此同时，上皮性HPV(+)患者的生存期中位数接近90%相比，尽管由于随访充分且人数少，差异并不显著。
图4，TCGA队列的不同的遗传改变和HNSCC亚型临床特征
最后看一下HNSCC的基因组改变情况，上面已经发现miRNA亚型中的表达模式与正常对照不同，突变评估主要对肿瘤纯度和病理生理学的评估具有指导意义。首先，值得注意的是，在基质肿瘤中发现的典型TP53突变比上皮肿瘤多，分别为77.8%和68.5% (p = 0.04)，这与口腔肿瘤更多地被非恶性细胞浸润的事实不一致。进一步考虑除了TP53的频率，是否在不同亚型之间存在其他突变差异，观察到miRNA为基础HNSCC亚型表现出明显的体细胞突变模式如图5所示。除TP53 (p = 0.041)外，NSD1 (p < 0.001)、HRAS (p = 0.018)和ZNF521 (p = 0.003)在各亚型之间也有显著差异突变。上皮亚型包含大部分NSD1突变(占57个突变总数的82.5%)，与基质亚型相比，它含有NSD1突变的肿瘤比例更高(16.4% vs 5.8%)。相反，基质亚型表现出较低的两种HRAS率(2.9% vs 8.5%)和ZNF521 (0.5% vs 6.3%)突变。接着对纯度进行定量评估，即评估基因组中的拷贝数变化(图5B)。间质肿瘤和上皮肿瘤在染色体增益(3q, 5p, 8q)和损失(3p和8p)上表现出相似的强度和分布。得到的结论倾向于，miRNA亚型不太可能主要由正常的基质污染或炎症浸润来定义，而更可能是由肿瘤内在因素(如突变、分化阶段和其他引导基因和miRNA表达异质性状态的特征)所决定的。
图5，在TCGA队列中，HNSCC亚型具有明显的遗传改变特征
这个研究表明基于miRNA的特征可以区分肿瘤中的上皮和间质亚型，这表明癌症的分类可能反映了与正常生理相关的过程。可以结合自有样本的测序数据和数据库数据，进行无监督样本分类，讨论肿瘤分型的情况和聚类后cluster的特征代表性是否具有普遍意义。
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